Пцр анализ

Пцр анализ

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR) изобрёл в 1983 году Кэри Мюллис (американский учёный). Впоследствии он получил за это изобретение Нобелевскую премию. В настоящее время ПЦР-диагностика является, одним из самых точных и чувствительных методов диагностики инфекционных заболеваний.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). В результате нарабатываются количества ДНК, достаточные для визуальной детекции. При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце.

Кроме простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК), и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, введения мутаций, выделения новых генов.

Специфичность и применение

ПЦР позволяет диагностировать наличие долго растущих возбудителей, не прибегая к трудоёмким микробиологическим методам, что особенно актуально в гинекологии и урологии при диагностике урогенитальных инфекций, передающихся половым путем (ИППП).

Также, этим методом проводят диагностику вирусных инфекций, таких как гепатиты, ВИЧ и др. Чувствительность метода значительно превосходит таковую у иммунохомических и микробиологических методов, а принцип метода позволяет диагностировать наличие инфекций со значительной антигенной изменчивостью.

Специфичность ПЦР при использовании технологии PCR даже для всех вирусных, хламидийных, микоплазменных, уреаплазменных и большинства других бактериальных инфекций достигает 100%. Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно.

Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и скрыто существующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях.

Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва и т. д.). В урологической и гинекологической практике — для выявления хламидиоза, уреаплазмоза, гонореи, герпеса, гарднереллёза, микоплазменной инфекции, ВПЧ — вирусов папилломы человека; в пульмонологии — для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулёза; в гастроэнтерологии — для выявления хеликобактериоза; в клинике инфекционных заболеваний — в качестве экспресс-метода диагностики сальмонеллёза, дифтерии, вирусных гепатитов В, С и G; в гематологии — для выявления цитомегаловирусной инфекции, онковирусов.

Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами — короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18 — 30 букв. Каждый из праймеров сопоставим (комплементарен) с одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка.

После соединения (гибридизации) матрицы с праймером (отжиг), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы.

  • ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать;
  • два праймера, комплементарные концам требуемого фрагмента;
  • термостабильная ДНК-полимераза;
  • дезоксинуклеотидтрифосфаты (A, G, C, T);
  • ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы;
  • буферный раствор.

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1°C. Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Добавление специфичеких ферментов может увеличить выход ПЦР-реакции.

Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от праймеров и обычно выбирается на 4 — 5°С ниже их температуры плавления. Время стадии — 0,5 — 2 минут.

ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы наиболее активны при 72°C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 10 — 15 мин.

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота — биологический полимер, один из двух типов нуклеиновых кислот, обеспечивающих хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов. Основная роль ДНК в клетках — долговременное хранение информации о структуре РНК и белков.

РНК – рибонуклеиновая кислота — биологический полимер, близкий по своему химическому строению к ДНК. Молекула РНК построена из тех же мономерных звеньев — нуклеотидов, что и ДНК. В природе РНК, как правило, существует в виде одиночной цепочки. У некоторых вирусов РНК является носителем генетической информации. В клетке играет важную роль при передаче информации от ДНК к белку. РНК синтезируется на ДНК-матрице. Процесс этот называется транскрипцией. В ДНК имеются участки, где содержится информация, ответственная за синтез трех видов РНК, различающихся по выполняемым функциям: информационной или матричной РНК (мРНК), рибосомальной (рРНК) и транспортной (тРНК). Все три вида РНК тем или иным способом участвуют в синтезе белка. Однако информация по синтезу белка содержится только в мРНК.

Нуклеоти́ды — основная повторяющаяся единица в молекулах нуклеиновых кислот, продукт химического соединения азотистого основания, пятиуглеродного сахара (пентозы) и одной или нескольких фосфатных групп. Нуклеотиды, представленные в нуклеиновых кислотах, содержат одну фосфатную группу. Они называются по содержащемуся в них азотистому основанию — адениновый (A), содержащий аденин, гуаниновый (G) — гуанин, цитозиновый (C) — цитозин, тиминовый (Т) — тимин, урациловый (U) — урацил. В состав ДНК входят 4 типа нуклеотидов — A, T, G, C, в состав РНК также 4 типа — A, U, G, C. Сахаром в составе всех нуклеотидов ДНК является дезоксирибоза, РНК — рибоза. При образовании нуклеиновых кислот нуклеотиды, связываясь, образуют сахаро-фосфатный остов молекулы, по одну сторону которого находятся основания.

Праймер – котроткая ДНК, используемая для репликации матричной цепи. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка.

Источник:
Пцр анализ
В конце статьи см. словарь Полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR) изобрёл в 1983 году Кэри Мюллис (американский учёный). Впоследствии он получил за это изобретение Нобелевскую премию. В
http://www.invitro.ru/for-clients/mat/1133/

ПЦР анализ

Анализ ПЦР является самым современным, быстрым и точным методом диагностики на сегодняшний день. В 1993 году американский ученый Кэрри Мюллис за открытие метода (ДНК метод) был удостоен Нобелевской премии.

Невероятно быстро, хотя ПЦР анализ применялся для научных экспериментов, метод стал популярен в практической медицине. Особенно актуален этот метод лабораторной диагностики в последнее время, когда увеличилось количество малосимптомных, скрытых форм венерических заболеваний. С помощью такого анализа можно за один забор материала провести анализ сразу на несколько инфекций, так как часто венерологи, в своей практике, сталкиваются с ассоциациями инфекций, передаваемые половым путем.

Основное направление ПЦР — это увеличение копий гена. За несклько циклов ПЦР происходит экспоненциальное копирование единичного гена. Такой процесс в этой реакции называется амплификацией.

ПЦР активно используется, в настоящее время, всеми ведущими лабораторными комплексами, как за пределами нашей страны, так и в самой России.

Высокая специфичность этого метода диагностики (pcr) характерна тем, что в исследуемом материале выделяется уникальный, специфичный только для данного микроорганизма фрагмент ДНК.

Метод позволяет обнаружить даже единичные клетки микроорганизмов. Можно найти присутствие возбудителей инфекционных агентов даже в тех случаях, когда другими способами диагностики (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать нереально.

Анализ незаменим в отношении инфекционных агентов с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов.

Особенно надо отметить одно из очень важных качеств ДНК диагностики — это её оперативность. Время от забора материала до получения лабораторных данных, а следовательно подтверждения диагноза занимает 1-2 дня, что очень важно для экспресс анализов.

И еще, ПЦР отличает от других методов диагностики, то что с помощью полимеразной реакции можно определить широкий спектр возбудителей при всего одном заборе материала.

И именно в венерологии, сейчас чаще всего пользуются данным методом, причем медцентры и лаборатории, предлагают определить сразу несколько инфекций, в комплексе с существенной скидкой.

Как и всех методов лабораторной диагностики ПЦР имеет и свои недостатки. Прежде всего высокотехнологичный метод требует высокой квалификации персонала лаборатории.

Другой существенный момент — это строжайшее соблюдение правил проведения диагностики. В лаборатории должны присутствовать мощные фильтры очистки воздуха, иначе неизбежны ошибки в анализе.

Метод ПЦР состоит из трех составляющих: пробоподготовка, амплификация и непосредственное получение результатов.

Следующий момент — это правила забора материала и доставки его непосредственно для анализа. Нужно также учитывать специфику транспортировки.

Важно соблюдать сроки проведения контрольных анализов.

Материалом для исследования служит ДНК возбудителя. Метод основан на выявлении фрагмента ДНК или РНК, являющегося специфичным для конкретного организма. Универсальность метода обусловлена также тем, что можно выявлять сразу несколько инфекций из одной биопробы.

Анализ ускоряет получение результатов диагностики. Для проведения не требуется выделение и выращивание культуры возбудителя, что занимает большое количество времени. Для данного метода ( в качестве исследуемого материала) возможно использование биологических выделений (слизь, мокрота, соскобы со слизистых, моча, кровь.).

Метод полностью автоматизирован, что позволяет существенно сократить время лабораторной диагностики. Очень эффективен анализ для диагностики вялотекущих, скрытых инфекций. Такой вид диагностики позволяет определить скрытые (малосимптомные), хронические формы гонореи.

ПЦР , на данный момент, один из самых чувствительных анализов на инфекции, передаваемые половым путем. Особенно эффективен данный метод для проведения анализов сложных форм возбудителей, с которыми нередко имеют дело врачи при скрытых, малосимптомных и хронических инфекциях, так как полимеразная реакция позволяет обойти трудности, связанные с выращиванием таких возбудителей в лабораторных условиях.

Таким способом возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва и т.д.).

Источник:
ПЦР анализ
ПЦР анализ Анализ ПЦР является самым современным, быстрым и точным методом диагностики на сегодняшний день. В 1993 году американский ученый Кэрри Мюллис за открытие метода (ДНК метод) был удостоен Нобелевской премии. Нев
http://yromed.ru/pcr.htm

COMMENTS